质谱流式细胞术技术简介
传统的流式细胞仪以荧光基团为报告分子，通过量化发射光的强度来确定目标分子的表达量，但荧光基团的发射光谱往往会重叠，尤其是在同一实验中多参数测量的情况下，很难区分多个荧光基团。质谱流式细胞仪使用单一分子量的稳定镧系金属代替荧光基团作为报告分子。元素质谱仪可以通过分子量准确区分不同的原子质量，不同镧系金属质量之间没有信号重叠，增加了定量的准确性。
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目前质谱流式细胞仪可以同时检测51个目标蛋白，每秒1000个细胞，平均每天100个样本。最低检测限为100拷贝分子，已验证的镧系金属标记抗体有400多种。除了常规的蛋白质，还可以用质量流式细胞仪检测蛋白质翻译后修饰1、蛋白质降解产物5、细胞存活率、细胞大小、mRNA转录本表达6、DNA合成速率7、蛋白酶活性8。
就像蛋白质组学中的未标记定量一样，质谱流式细胞术对靶标的定量准确性也受到不同仪器电离效率差异和仪器状态的影响。同时，传统的质谱流式细胞仪一次只能检测一个样品，通量较低。因此，mass-tag蜂窝条形码(MCB)应运而生。
细胞经药物等处理后，用多聚甲醛固定，再用MCB试剂标记不同样品的细胞，然后将不同样品混合预处理，用常规质谱流式细胞仪检测。最后，通过检测与条形码相对应的元素离子来对细胞样品进行分类。
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图二。多通道质谱流式细胞术
多通道质谱流式细胞仪的实验步骤如图2所示。不同处理的样品用甲醛固定，不同的样品用不同的mDOTA分子标记，然后进行常规质谱流式细胞仪的预处理和检测。
这里使用的mDOTA分子是一种双功能化合物，一端可以螯合金属离子，另一端可以以价键的形式与细胞内蛋白质上的游离巯基结合(如图3)。一个mDOTA分子可以螯合一个镧系金属原子，那么为什么叫条形码呢？条形码是指可以同时添加多种镧系金属元素螯合的mDOTA分子。CyTOF中* * *价键断裂后，各镧系金属元素的峰可以在有或无两种情况下形成。镧系金属元素螯合的mDOTA试剂的种类越多，最终形成的条形码种类就越多。如图4所示，用镧系金属元素螯合的7种mDOTA试剂可形成2 7种条形码，可同时标记。通过使用MCB，可以用一个细胞同时对多个样品进行定量分析，增加了质谱流式细胞仪的分析通量，提高了相对定量精度。本文开头提到的细胞干细胞，就是利用MCB技术，在单细胞水平上研究人类红细胞生成过程中内源性转录因子的表达和调控。
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图3。M DOTA的分子反应原理
细胞用* * *价键形式的双功能分子mdota(马来酰亚胺-单酰胺-dota)标记。mDOTA的一端可以螯合稀土元素，另一端可以与细胞内蛋白质的巯基反应。
然而，MCB也有一些缺陷。首先，每次仪器校准后，质谱流式细胞仪的离子检测灵敏度都会发生变化，虽然可以使用内参进行校准，混合样品后检测会降低样品间的变化程度。其次，MCB中使用的镧系金属元素和后面使用的抗体偶联的镧系金属不能相同，所以MCB的使用缩小了后续标记抗体的选择范围。所以后来又进一步开发了基于钯的MCB试剂，11。利用钯的六个同位素原子构建MCB分子有以下两个优点:首先，钯与标记抗体的试剂(DTPA基聚合物)不相容，因此MCB分子中钯的使用不会干扰后续标记抗体的选择；其次，Pd有六种稳定同位素，102、104、105、106、108和10AMU，纯度分别为91%。
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图4。微型断路器的形成原理
使用7种镧系金属螯合的mDOTA试剂，按图中分布加入mDOTA试剂，可形成2的7次方条形码，即可同时标记128个样品。
最后简单说一下这项技术的优缺点。优点是可以同时检测的通道多，现在可以同时检测51个目标蛋白；可操作性强，试剂商品化；虽然速度没有流式细胞仪快(每秒10000个细胞)，但也不慢，每秒可以检测1000个细胞。成本低，每个细胞的平均测量成本仅为0.005美分，与单细胞测序技术平均每个细胞22美元相比，相当便宜。
当然，目前这项技术还存在很多不足。首先，细胞在分析中被原子化、离子化，分析后无法保留完整的活细胞状态；其次，灵敏度低于荧光基团，无法检测表达水平极低的分子，检测的动态范围最多只能达到3-4倍，而荧光基团的检测范围可以达到50倍左右；再次，不同仪器的电离效率不同，需要加入聚苯乙烯珠对信号强度进行校正，实现同一仪器数据的比对；第四，和基于荧光基团的流式细胞仪一样，质谱流式细胞仪仍然不能检测小分子的代谢产物，不能连续动态监测一个细胞。最后，也是最重要的一点，我们无法监测蛋白质组中的所有蛋白质，只能监测特定的目标蛋白质，因此需要更加严谨的实验设计。
无论如何，质谱流式细胞仪技术还在发展和完善，越来越多的问题可以通过这项技术解决。希望这次对质谱流式细胞仪的系统介绍，也能为我们目前面临的问题提供一些新的思路，为我们的项目做出贡献。(来源:清华大学蛋白质研究技术中心蛋白质化学与组织学平台)
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