张伟明中国科学技术大学
目的研究杜仲叶中绿原酸的提取和纯化方法。方法采用水提、絮凝脱色、树脂吸附、重结晶等方法提取纯化产品。结果杜仲叶浓缩水提液用1%壳聚糖絮凝除杂，活性炭脱色，得到注射液。注射液用NKA-9树脂吸附，用50%乙醇解吸，浓缩的粗洗脱液用甲醇重结晶，得到纯度≥97%的绿原酸，提取率≥65%。结论优化和改进了杜仲叶中绿原酸的提取和纯化方法，为杜仲资源的综合利用和产业化开发提供了参考。
关键词:绿原酸；摘录；净化；杜仲叶
杜仲中绿原酸的提取和纯化研究。离开
原华，邓亮，杨晓？小君，阎志？郭，吴元？辛
(武汉工程大学化学工程与制药学院，武汉430073)
目的研究杜仲中绿原酸的最佳提取纯化工艺。树叶。方法水提、1%壳聚糖絮凝、活性炭脱色、NKA？9树脂吸附、50%乙醇解吸和甲醇重结晶。结果绿原酸提取率为68%，纯度为97%。结论优选并改进了杜仲绿原酸的提取纯化工艺。叶子被调查了。这有助于绿原酸的工业化生产。
关键词:绿原酸；提取；净化；杜仲。
杜仲。是我国特有的经济树种，其药用价值一直备受关注。绿原酸是杜仲的主要有效成分。具有抗菌、抗病毒、利胆、保肝、抗高血压和清除自由基的作用。2000多年前，在《神农本草经》中被列为中药上品。近年来研究表明，杜仲叶的主要化学成分与杜仲皮基本相同，杜仲叶中绿原酸含量更丰富，达到干叶重的1%~5%，因此从原料丰富、价格低廉的杜仲叶中提取绿原酸成为研究热点[1 ~ 3]。其中，华乾[4]和刘俊海[5]提出的大孔吸附树脂提取纯化方法显示了一定的工业化前景，但已报道的树脂分离效果不一致，没有最终产品纯度和收率的报道。杜仲叶提取物除绿原酸外，还含有鞣质、蛋白质、多糖等物质。为了获得高纯度的绿原酸，需要在多个步骤中分离和纯化提取物。本文在文献工作的基础上，围绕产业化目标，对提取制备工艺进行了改进，通过水提、絮凝脱色、树脂吸附、重结晶，提取制备了高纯度、高收率的绿原酸。
1材料和方法
1.1材料和仪器杜仲叶采自湖北五峰(风干，粉碎)；乙醇、甲醇、稀盐酸等主要试剂为分析纯；壳聚糖是一种生化试剂；NKA？9、AB？8、NKA？ⅱ型树脂(南开大学化工厂)；绿原酸(中国药品生物制品检定所)。ZF？I型紫外分析仪(上海顾村光电仪器厂)；安捷伦1100高效液相色谱仪。
1.2提取纯化工艺准确称取杜仲叶10.0 g，用2×120 ml去离子水80℃动态提取150 min，过滤，提取液减压浓缩至100 ml，浓缩液加入4ml 1%壳聚糖溶液絮凝，过滤。9.将样品上清液用树脂吸附，用50%乙醇溶液洗脱，洗脱液减压浓缩得到绿原酸粗品，用甲醇重结晶得到绿原酸纯品。提取率≥65%(以杜仲叶中绿原酸含量计)，纯度≥97%。
1.3绿原酸含量的测定绿原酸含量的测定根据参考文献[6，7]进行。
2个结果
2.1提取条件
2.1.1提取溶剂的选择杜仲叶中的绿原酸一般用40%的乙醇水溶液提取。使用乙醇水溶液进行提取，不仅增加了溶剂成本，还增加了提取物中的脂溶性成分，给后续处理带来困难。绿原酸在热水中具有高溶解度。本文选择水作为提取溶剂。
2.1.2提取温度的选择随着提取温度的升高，绿原酸的得率不断增加，当温度高于80℃时，绿原酸的得率开始下降。随着温度的升高，杜仲叶中其他成分的溶出也在增加，考虑到绿原酸的热不稳定性，提取温度控制在80℃以下。
2.1.3提取时间的影响随着时间的延长，绿原酸的得率逐渐增加，尤其是在50 ~ 150 min内，两者呈现良好的线性关系，然后逐渐达到一个提取平衡状态。
2.1.4提取液pH值的影响在温度、固液比、提取时间相同的条件下，用稀盐酸调节提取溶剂的pH值，当pH值为4时，绿原酸的收率较高。因此，绿原酸的最佳提取条件为:杜仲叶每片。是10.0 g，用2×120 ml去离子水在pH=4，温度80℃下动态提取150 min。
2.2絮凝脱色在中药提取过程中，常采用水提醇沉的方法，目的是去除提取液中的淀粉、胶质、蛋白质、粘液、果胶、多糖、无机盐等无效成分。发现水提醇沉法中醇浓度越高，除杂效果越好，但醇沉导致的有效成分损失也增加。此外，水提醇沉工艺还存在乙醇用量大、生产成本高、安全系数低等缺点，有必要对工艺进行改进。絮凝澄清法是在中药提取液或浓缩提取液中加入絮凝剂，通过吸附架桥和电中和作用去除溶液中的部分物质，从而达到分离纯化的目的[8]。通过对絮凝剂种类、浓度、絮凝温度和酸度的选择和比较，确定最佳絮凝脱色工艺为:每100 ml浓缩液加入4ml 1%壳聚糖溶液，搅拌，60℃静置60 min，过滤，滤液用1g活性炭脱色，得到澄清的注射液。
2.3大孔吸附树脂的选择结合杜仲叶提取物的特性，本文比较选择了三种极性大孔吸附树脂NKA-9、AB-8和NKA-ⅱ。预处理和再生后，进行静态吸附和解吸实验。三种不同类型的大孔吸附树脂对绿原酸溶液(4.8mg·mL-1，10 mL)的吸附量、吸附率、解吸率见表1。
表1三种树脂对绿原酸的吸附和解吸(略)
由表1可知，三种大孔吸附树脂对绿原酸的吸附量和吸附率均较高，但AB-8树脂吸附的绿原酸难以解吸，不适合分离绿原酸。只有NKA-9和NKA-II树脂是合适。相比较而言，NKA-9树脂在静态吸附时具有较高的吸附容量和吸附速率，且易于解吸，对绿原酸具有较好的富集效果。
2.4树脂对绿原酸的吸附实验
2.4.1动态吸附曲线将浓度为3.0mg·mL-1的绿原酸溶液加入到装有200gNKA-9大孔树脂的玻璃色谱柱中，当流速为2.0mL·min-1时(可表示为BV/h，即每小时流经床层的流动相体积为树脂床层体积的倍数。结果表明，该树脂可处理7 ~ 8倍体积的树脂床。
图1 NKA-9树脂对绿原酸的吸附曲线(略)
2.4.2注射液流速对吸附的影响为了进行有效的吸附，必须使固液两相在树脂吸附过程中有足够的接触时间。当注射流速过高时，树脂不能吸附绿原酸，导致吸附率下降。注射流量太小，虽然吸附充分，但吸附时间长，效率低。将浓度为3.0mg·mL-1的绿原酸溶液过柱，考察树脂单位时间的吸附量与不同进样流速的关系。结果表明，当流速为2.0mL·min-1时，吸附效果最好。参见图2。
图2注射液流速对吸附的影响(略)
2.4.3注射液pH值对吸附的影响在不同pH值下进行了吸附实验。结果表明，绿原酸作为一种多羟基酚酸，在酸性条件下容易被吸附。由于绿原酸在酸性条件下以分子形式存在，增强了树脂对绿原酸的吸附；内酯形式的绿原酸在强酸条件下容易水解；在碱性条件下，离子形式的绿原酸不容易被吸附。从图3可以看出，pH值为3时，吸附效果最好。
2.5树脂对绿原酸的解吸实验
2.5.1洗脱剂的选择化合物被树脂吸附后，根据吸附的强弱选择不同的洗脱剂。一般来说，吸附剂通过分子间分散力与吸附剂相互作用时，吸附力较弱，容易洗脱。而吸附剂和吸附质通过偶极力或氢键作用时，吸附力强，不易洗脱。NKA-9大孔树脂极性强，绿原酸是含有酚羟基的化合物，容易与树脂形成氢键。需要溶解性更强的溶剂来洗脱绿原酸。在本实验中，选择不同浓度的乙醇水溶液作为洗脱剂，结果如图4所示。
图3注射液pH值对吸附的影响(略)
图4洗脱液乙醇浓度与解吸率的关系(略)
实验用不同浓度的乙醇溶液进行洗脱，测定洗脱液中绿原酸的含量，计算解吸率。其中50%和70%的乙醇溶液基本可以洗脱树脂吸附的绿原酸。对洗脱液的薄层分析表明，70%乙醇溶液虽然解吸率高，但洗脱液中的杂质含量也高，达不到有效成分的分离效果，因此实验选用50%乙醇溶液作为洗脱液。
2.5.2洗脱曲线的绘制样品清液吸附后，用50%乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在1.0BV/h/h，收集洗脱液，测定洗脱液中绿原酸的含量，绘制洗脱曲线，如图5所示。
图5 NKA-9树脂洗脱曲线(略)
可以看出，用3倍树脂床体积的洗脱剂基本可以洗脱绿原酸，且洗脱峰集中。减压浓缩50%乙醇洗脱液，低温干燥，得到绿原酸粗品。
2.6.绿原酸粗品用甲醇重结晶，真空干燥，得到白色针状晶体。产物的结构经红外光谱和核磁共振氢谱分析确证，HPLC测定含量为97.95438±0%。
3结论
本研究对杜仲叶中绿原酸的提取工艺条件进行了优化:杜仲叶用去离子水在80℃下提取65438±050min，提取液经浓缩、絮凝除杂、吸附脱色后得到样品溶液。样品溶液经NKA-9大孔树脂处理得到绿原酸粗品，粗品经重结晶得到含量≥97%的绿原酸，提取率≥65%。杜仲。我国资源丰富，从杜仲中提取绿原酸的工艺条件优化。叶为杜仲的充分综合利用和产业发展提供了基础数据。
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